客户常见问题解答
longmed, Inc.

1. 咨询email邮箱:
对于生物发光体内成像的问题， 请发邮件至 info@longmed.com

2. 如何保证荧光酶(LUCIFERASE)的稳定性
荧光酶基因是插到细胞染色体内的, 当细胞分裂, 转移, 分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达
荧光酶的半衰期约三小时, 所以只有活细胞才能够持续表达荧光.

3. 荧光酶的发光是否需要激发光?
荧光酶的发光是生物发光, 不需要激发光, 但需要底物荧光素(LUCIFERIN). 荧光素是一种水溶性和脂溶性都非常好的小分子, 很容易穿透细胞膜和血脑屏障.

4. 底物荧光素(LUCIFERIN)是如何进入小鼠体内的? 需要多少?
荧光素是腹腔注射进入小鼠体内的. 约一分钟就可以扩散到小鼠全身. 20克的小鼠需要3毫克的荧光素, 价钱约三美元.

5. 荧光酶的发光特性如何?
荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光酶的细胞开始发光, 十分钟后强度达到最高. 在最高点持续约法20-30 分钟后开始衰落, 约三小时后荧光素排除, 发光全部消失. 所以, 最好的检测时间是在注射后15到25分钟之间.

6. 为何精诺真技术能看到体内发出的可见光?
两点主要原因使精诺真技术能够看到体内发出的微弱的可见光. 一是高灵敏度的制冷CCD镜头, 可达到零下-120C, 使体内发出的几个光子也能够检测到. 二是绝对密封的暗箱装置, 可以屏蔽包括宇宙射线在内的光线.

7. 精诺真技术如何定量分析
精诺真技术采取绝对光子数的计算方法, 记录单位时间内, 单位面积, 单位角度接受到的光子数. 这样, 不同时间, 不同仪器的测量结果可以进行比较, 具有绝对的定量意义.
每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验, 其中包括做一个在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线. 精诺真提供的每一种荧光酶标记的细胞株都做过精确全面的分析. 我们也为客户免费提供这些分析的方法.

8. 荧光酶的发光强度是否同细胞的数量成正比?
是的, 荧光酶的发光强度同标记的靶象, 包括细胞, 基因, 细菌, 和病毒的数量成正比. 密支根大学BRIAN ROSS 发表的一篇文章专门研究了这个问题(附上文章 ). 确定荧光酶的发光强度与细胞数成正比关系, 并且线性关系达到目的0.9 以上.

9. 仪器灵敏度如何?
仪器对发光细胞检测的灵敏度与细胞发光的强度有关. 在标记细胞活跃发光的情况下, 仪器可以检测到最少100个皮下接种(或叫皮下种植)的发光细胞. 若细胞在体内位置深(或叫原位种植), 比如内脏, 最少能检测到的细胞数目需要多一些.

10. 仪器的分辨率如何?
仪器对两个发光点的最高分辨率在1毫米左右.

11. 动物检验时的洁净度问题
若是用人源的癌细胞在小鼠身上做研究, 就需要使用裸鼠, 实验洁净度的要求就会高一些. 否则用老鼠的癌细胞株做研究, 正常老鼠就可以, 洁净度要求会小很多.

12. 细胞周期对荧光酶表达的影响
如果荧光酶的表达是在稳定的启动子控制下, 细胞周期对荧光酶的表达没有影响.

13. 转基因动物的荧光酶是随机还是插入固定的位点？
插入的位点是随机的, 但每一个构建好的细胞株我们都做过详细的分析, 与其母细胞株进行详细的比较, 证明荧光酶的插入对细胞的各种特性(包括生长周期, 成瘤性等)没有造成影响.

14. 标记细胞与标记基因所用启动子的不同
标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子, 显示细胞的数目. 标记基因一般用此基因的启动子, 与此基因平行表达, 显示此基因的表达数目.

15. 发光的波长与颜色
荧光酶发出的光主要是偏红光, 与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同. 荧光酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿色在体内的穿透性要强近一百倍.

16. 为什么用荧光酶, 而不是用绿色荧光蛋白来检测体内发光?
一方面是荧光酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿色在体内的穿透性要强近一百倍. 另一方面, 荧光酶是靠酶和底物的相互反应发光, 特异性很强. 这样一来, 得到的信躁比很高. 而荧光蛋白需要激发光来产生反射光. 老鼠的毛皮, 肌肤, 以及一些食物都会产生非特异性荧光, 造成很强的非特异性背景光, 干扰大, 得到的信躁比很小.
虽然荧光蛋白的发光强度很高, 大量应用于体外检测; 但荧光酶标记的方法更适合于体内检测. 荧光酶体内检测的灵敏度要比荧光蛋白在体内的灵敏度至少高三个数量级(1000倍). (若客户感兴趣, 可附上”荧光标记方法的比较”文章)

17. 能检测分散在各处的单个细胞吗，假如总数在100个细胞以上的话?
可以. 我们可以提供许多文章, 其中用荧光酶标记了T细胞, NK细胞, 造血干细胞和其他淋巴细胞. 在这些标记的细胞总数达到几百时, 我们的仪器可以观察到信号. 具体见这写研究文章(附上免疫和干细胞方面的文章)

18. 都有那些细胞株可以提供？
我们提供的细胞株包括常用的十几种人源的癌细胞和几种老鼠的癌细胞株(附上标记细胞列表). 购买我们仪器的客户我们都会赠送一到两种标记和分析好的细胞株.

19. 能检测在肌肤内部的发光吗？光能透过肌肤多深?
可以, 答案见问题8. 若有发光足够强的标记细胞, 在老鼠体内任何一个地方都能看到约一立方毫米的细胞瘤(约106细胞). 穿透性可达到3到4CM (小鼠身体的厚度约7到8 CM)

20. 能定位在哪个脏器吗？凭什么？
此技术无法直接定位标记细胞和基因所在的组织和器官. 但是实验人员凭经验, 可以靠发光细胞在老鼠的身体位置推断标记细胞或基因所在的脏器. 若需要证实, 还需要将老鼠解剖, 进行体外检测.

21. 成体可以看到吗？（有些人思维停留在看幼体或胚胎）
可以. 成体老鼠和裸鼠, 幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同, 不是半透明状态. 我们的技术可以看到成体正常老鼠的体内发光. 详细解释见18题.

22. 蛋白与蛋白的关系，如何研究？
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍, 可利用精诺真体内可见光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用(附上蛋白与蛋白相互作用的文章). 具体方法是: 将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上. 若是这两个蛋白质之间有相互作用, 荧光酶的C端和N端就会被带到一起, 产生发光现象. 详细内容见文章

23. 细胞凋亡的研究
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍, 可利用精诺真体内可见光成像技术直接观察活体动物体内的细胞凋亡(附上细胞凋亡的文章). 具体方法是: 用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素), 但在其连接处加上CASPASE(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点. 细胞发生凋亡时, 表达CASPASE, 切开抑制荧光酶发光的蛋白, 使荧光酶开始发光. 详细内容见文章

24. 体内可见光技术的发展过程
精诺真的研究人员在1995年对此技术开始研究, 技术在1999年才开始成熟, 精诺真的商业产品在2000年出现在市场上. 但大量的研究工作是在最近两年才开始的. 技术开始流行起来, 多数的文章也是在最近两年发表的.

25. 体内可见光技术和其它体内成像技术(正电子衍射PET, CT, 核磁共振MRI)的比较
优点: 适用于小动物的研究, 灵敏度高, 分辨率高. 操作简单, 无放射性, 价钱便宜
缺点: 暂不适用于人类和临床(正在研究中), 无三维成像(IVIS200除外), 体内精确定位有限

26. 基因有多大？蛋白有多大？
荧光素酶由554个氨基酸组成。

27. 那么低温度，动物不会冻死吗？
低温只是在CCD镜头的小环境内. 其它范围内都是室温. 放置动物的平台是可加热的, 可以保持在37度或任何温度.

28. 组织切片可以观察到生物发光吗？
可以, 但荧光酶的体外活性保持时间比较短.

29. 拍摄普通照片的和生物发光照片的是一个CCD镜头吗?
是, 只不过爆光时间和快门不一样.

30. 有哪些附件
精诺真公司还提供观察荧光发光的附件和小动物麻醉系统. 荧光发光附件包括一个激发光源, 一套滤光片, 可用于研究包括绿色荧光蛋白在内的荧光蛋白在体内和体外的检测.

31. 精诺真公司的情况
精诺真公司(XENOGEN)是在美国旧金山市的一个NASDAQ的上市公司. 公司由美国加州斯坦福大学(STANFORD)的几位生物学教授创建. 所以, 精诺真公司不是一个单纯的仪器公司, 他提供全套的生物学服务, 包括细胞的标记和荧光酶标记的转基因动物等. 公司研制出的仪器也完全是从生物学家应用的角度设计的, 直观, 简单, 适用.

32. 龙脉得公司的情况
龙脉得公司是由在美国学习和工作过的几位留学人员创建的. 我们具有生物学和基础医学的博士学位, 有国外最新生物学和医学研究的经验. 我们不仅仅提供最先进的生物学和医学研究技术和设备, 并且会提供国外生物学和医学研究的最新思想和理念, 保证您实验的成功, 保证您实验室的研究水平处于世界的前沿.